Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11066:2016 về Thực phẩm chức năng - Xác định hàm lượng glucosamin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được ban hành bởi Bộ Khoa học và Công nghệ, nhằm thiết lập một quy trình kỹ thuật chuẩn hóa, thống nhất trên phạm vi toàn quốc để kiểm tra và giám sát chất lượng các sản phẩm thực phẩm chức năng có chứa thành phần glucosamin.

Phạm vi và đối tượng áp dụng của tiêu chuẩn

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng glucosamin (bao gồm cả dạng glucosamin hydroclorid và glucosamin sulfat) trong các loại thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng áp dụng bao gồm các phòng thử nghiệm, cơ quan kiểm nghiệm thực phẩm Nhà nước, các tổ chức chứng nhận hợp chuẩn hợp quy, cùng các doanh nghiệp sản xuất, nhập khẩu và kinh doanh thực phẩm chức năng tại Việt Nam.

- Nguyên lý hoạt động của phương pháp

• Glucosamin có trong mẫu thực phẩm chức năng được giải phóng hoàn toàn khỏi nền mẫu bằng quá trình hòa tan và chiết xuất với dung môi thích hợp.
• Do glucosamin không có nhóm mang màu hoặc phát huỳnh quang mạnh, mẫu sau chiết xuất phải trải qua quá trình dẫn xuất hóa bằng tác chất chuyên dụng (như FMOC-Cl hoặc tác chất tương đương) để tạo ra dẫn xuất bền vững, có khả năng hấp thụ cực đại ở bước sóng tử ngoại hoặc phát huỳnh quang mạnh.
• Hỗn hợp sau phản ứng dẫn xuất được phân tách thông qua hệ thống sắc ký lỏng pha đảo sử dụng cột C18 và được phát hiện bằng detector tử ngoại (UV) hoặc detector huỳnh quang (FLD).
• Hàm lượng hoạt chất được định lượng bằng phương pháp ngoại chuẩn, so sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của dung dịch chuẩn glucosamin có nồng độ biết trước.

- Yêu cầu về thiết bị, dụng cụ và hóa chất

• Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đồng bộ, bao gồm bơm cao áp gradient hoặc đẳng dòng, bộ tiêm mẫu (tự động hoặc bằng tay), buồng điều nhiệt cột và detector UV hoặc detector huỳnh quang.
• Cột phân tích sắc ký pha đảo C18, kích thước hạt tĩnh từ 3 µm đến 5 µm, đảm bảo độ phân giải tốt giữa pic dẫn xuất glucosamin và các tạp chất khác trong nền mẫu.
• Cân phân tích có độ nhạy cao, sai số không quá 0,1 mg để cân mẫu và chất chuẩn.
• Các thiết bị phụ trợ bắt buộc bao gồm máy lắc siêu âm hỗ trợ quá trình chiết xuất, máy ly tâm tốc độ cao, bộ lọc dung môi và màng lọc mẫu có kích thước lỗ lọc không quá 0,45 µm.
• Hóa chất sử dụng phải đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích hoặc tiêu chuẩn dùng cho HPLC, bao gồm acetonitril, metanol, nước cất siêu sạch (nước loại 1), các muối tạo đệm phốt phát hoặc axetat, và chất chuẩn glucosamin hydroclorid có chứng nhận xuất xứ rõ ràng.

- Quy trình chuẩn bị mẫu và tiến hành thử nghiệm

• Chuẩn bị mẫu thử: Đối với dạng viên nén hoặc viên nang, tiến hành nghiền mịn và đồng nhất hóa mẫu. Đối với dạng lỏng hoặc bột, trộn đều trước khi cân. Cân chính xác một lượng mẫu thử thích hợp sao cho hàm lượng glucosamin nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn.
• Chiết xuất hoạt chất: Hòa tan lượng mẫu đã cân bằng dung dịch đệm hoặc nước, tiến hành lắc siêu âm trong khoảng thời gian quy định để giải phóng hoàn toàn glucosamin, sau đó lọc qua màng lọc để thu được dịch trong suốt.
• Phản ứng dẫn xuất hóa: Hút một thể tích dịch lọc mẫu và dung dịch chuẩn chính xác vào các ống nghiệm riêng biệt. Thêm dung dịch đệm borat (để kiểm soát pH) và tác chất dẫn xuất hóa FMOC-Cl. Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ ổn định trong thời gian xác định, sau đó dừng phản ứng bằng tác chất thích hợp trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.
• Vận hành sắc ký: Thiết lập các thông số vận hành hệ thống HPLC (tốc độ dòng, nhiệt độ cột, bước sóng phát hiện của detector). Tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiêm dung dịch mẫu thử để tiến hành phân tích.

- Tính toán, biểu thị kết quả và độ chụm của phương pháp

• Hàm lượng glucosamin trong mẫu thử được tính toán dựa trên diện tích pic thu được từ sắc ký đồ, áp dụng công thức nội suy từ đường chuẩn tuyến tính của chất chuẩn.
• Công thức tính toán phải tính đến khối lượng mẫu cân ban đầu, các hệ số pha loãng trong quá trình chiết xuất và dẫn xuất hóa, cũng như hàm lượng ẩm hoặc độ tinh khiết của chất chuẩn sử dụng.
• Kết quả cuối cùng được biểu thị bằng miligam glucosamin trên một đơn vị khối lượng mẫu (mg/g) hoặc phần trăm khối lượng (%).
• Tiêu chuẩn cũng quy định cụ thể về độ chụm của phương pháp, bao gồm độ lặp lại (sự chênh lệch giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập thực hiện bởi cùng một kiểm nghiệm viên trên cùng một mẫu thử không được vượt quá giới hạn cho phép) và độ tái lặp giữa các phòng thử nghiệm khác nhau.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11066:2016 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày công bố. Việc áp dụng thống nhất tiêu chuẩn này giúp nâng cao năng lực kiểm nghiệm, bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng và tạo sự minh bạch cho thị trường thực phẩm chức năng tại Việt Nam.