Tóm tắt Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10412-1:2014 (ISO 10633-1:1995) - Phần 1: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10412-1:2014 hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn quốc tế ISO 10633-1:1995. Văn bản này quy định chi tiết phương pháp xác định hàm lượng các glucosinolat cá biệt trong khô dầu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Dưới đây là tóm tắt chuyên sâu về phần mở đầu và các điều khoản cốt lõi từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn.

Điều 1: Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng của các glucosinolat cá biệt có trong các loại khô dầu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Các quy định cụ thể về phạm vi áp dụng bao gồm:

• Phương pháp này áp dụng đối với các loại khô dầu thu được sau quá trình ép hoặc chiết dầu từ các loại hạt có dầu, đặc biệt là khô dầu cải dầu (rapeseed meal).
• Phương pháp cho phép định lượng riêng biệt từng loại glucosinolat cụ thể (như progoitrin, sinigrin, gluconapin, glucobrassicanapin, gIucoiberin, glucoraphanin,...) chứ không chỉ xác định hàm lượng glucosinolat tổng số.
• Giới hạn phát hiện và độ chính xác của phương pháp đáp ứng các yêu cầu nghiêm ngặt trong phân tích thương mại và kiểm soát chất lượng thức ăn chăn nuôi.

Điều 2: Tài liệu viện dẫn

Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, các tài liệu viện dẫn sau đây là cực kỳ cần thiết. Đối với các tài liệu ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu; đối với các tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất (bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung):

• TCVN 4325 (ISO 6497) về Thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu.
• TCVN 6952 (ISO 6498) về Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử.

Điều 3: Nguyên tắc của phương pháp

Quy trình phân tích hàm lượng glucosinolat bằng phương pháp HPLC dựa trên nguyên lý hóa - sinh kết hợp sắc ký pha đảo, bao gồm các bước cốt lõi sau:

• Chiết xuất: Các glucosinolat trong mẫu khô dầu được chiết bằng hỗn hợp methanol và nước ở nhiệt độ cao (thường là methanol 70% đun nóng ở 70 độ C) nhằm bất hoạt hoàn toàn enzym myrosinase tự nhiên có trong mẫu, ngăn chặn sự phân hủy của glucosinolat trong quá trình chuẩn bị mẫu.
• Làm sạch và chuyển hóa trên cột: Dịch chiết sau đó được cho đi qua một cột trao đổi ion siêu nhỏ chứa nhựa DEAE-Sephadex A-25. Các glucosinolat (mang điện tích âm) sẽ được giữ lại trên cột. Tiếp theo, bổ sung enzym sulfatase vào cột để thực hiện phản ứng khử nhóm sulfat trực tiếp trên cột, chuyển hóa các glucosinolat thành các desulfoglucosinolat tương ứng (hợp chất không mang điện tích).
• Rửa giải: Các desulfoglucosinolat được rửa giải ra khỏi cột bằng nước cất hoặc dung dịch rửa giải thích hợp.
• Phân tích sắc ký (HPLC): Dịch rửa giải chứa các desulfoglucosinolat được tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC), sử dụng cột C18 và detector quang phổ tử ngoại (UV) ở bước sóng tối ưu 229 nm để phát hiện và ghi lại sắc ký đồ.
• Định lượng bằng chất chuẩn nội: Việc định lượng từng loại glucosinolat được thực hiện bằng cách so sánh diện tích pic của chúng với diện tích pic của chất chuẩn nội (thường sử dụng sinigrin hoặc glucotropaeolin) được thêm vào mẫu ngay từ giai đoạn chiết xuất ban đầu, kết quả được tính toán dựa trên các hệ số đáp ứng tương đối đã được thiết lập.

Điều 4: Thuốc thử và vật liệu thử nghiệm

Tất cả các hóa chất, thuốc thử được sử dụng phải đạt độ tinh khiết phân tích chuyên dụng cho sắc ký. Nước dùng trong quá trình phân tích phải là nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. Các thuốc thử chính bao gồm:

• Methanol: Dung dịch methanol nồng độ 70% (thể tích) dùng cho quá trình chiết xuất và methanol khan dùng làm pha động cho hệ thống HPLC.
• Chất chuẩn nội: Sinigrin monohydrat hoặc glucotropaeolin (benzylglucosinolat) có độ tinh khiết tối thiểu 98%, được chuẩn bị thành dung dịch chuẩn nội có nồng độ chính xác.
• Enzym sulfatase: Được điều chế từ nguồn thích hợp (như từ dịch dạ dày của ốc sên Helix pomatia) và phải được làm sạch để loại bỏ hoàn toàn các hoạt tính enzym tạp nhiễm khác có thể gây phân hủy desulfoglucosinolat.
• Nhựa trao đổi ion: DEAE-Sephadex A-25 dạng huyền phù trong nước hoặc dung dịch đệm thích hợp để nạp vào cột trao đổi ion siêu nhỏ.
• Pha động HPLC: Hỗn hợp nước và axetonitril hoặc methanol, được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45 micromet và được khử khí hoàn toàn trước khi đưa vào hệ thống sắc ký.